P450酶催化反应区域和化学选择性的结构基础及机理获进展

　   近日，中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室（LMB）研究员张长生团队在多环大环内酰胺类天然产物生物合成酶学机制研究方面取得新进展。相关成果 “A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates” 在线发表于Angewandte Chemie (《德国应用化学》) 

　　惰性C-H键活化是合成高价值化合物的关键环节，主要依靠过渡金属催化，难以控制区域/立体/化学选择性，一度被称为有机化学中的“圣杯”。而在自然界中，少数细胞色素P450酶可以轻松有序地催化多步C-H键活化反应，且具有高度的区域/立体/化学选择性，是形成许多重要天然产物的关键环节。这些P450酶被称为多功能P450酶，是合成生物学应用的重要酶元件，但由于解析的复合物晶体结构有限，酶控制多步反应和精准选择性的酶学机制仍有待阐明。以ikarugamycin为代表的多环大环内酰胺类天然产物(PoTeMs)是药物先导化合物和生物农药的重要资源。在PoTeMs生物合成中，P450酶介导的后修饰极大丰富了化学结构和生物活性。有趣的是，其中的多功能P450酶IkaD和CftA被报道都天然识别ikarugamycin（1），但得到不同的氧化产物：IkaD先氧化C7=C8双键形成环氧，再羟基化C29，获得产物capsimycin G（1b）；而CftA先催化形成C29酮基，再微弱催化C30羟基化反应获得产物clifednamide C（1d）（图1）。 

　　为了揭开P450酶IkaD和CftA催化功能差异的神秘面纱，研究团队首先解析了IkaD和CftA与共同底物1的复合结构。发现二者的整体三维骨架基本重合，是典型的金字塔形P450骨架，但参与构成催化口袋的FG区域的构象明显不同，从而影响了催化口袋的形状（图1），使得同一个底物1朝向两个酶血红素铁反应中心的距离和角度不同（图2），最终决定了酶催化反应的区域和化学选择性。基于这一发现，研究团队通过理性设计，对远离血红素铁反应中心的极性氨基酸开展单点突变，发现IkaD的部分突变酶能够改变催化反应的区域选择性，形成天然分离未发现过的人工新产物。 

　　图1. 多功能P450酶IkaD和CftA对相同底物的不同区域/化学选择性及其结构基础 

　　接着，研究团队以不同骨架的PoTeMs底物开展系统性的体外酶学测试，发现IkaD和CftA都能识别催化非天然底物，但与区域选择性不同。分别解析IkaD和CftA与非天然底物的复合物晶体结构（图2），发现非天然底物并没有诱导IkaD和CftA发生构象变化，保持了二者FG区域的构象差异，最终决定了对非天然底物的位点选择性和反应顺序。有趣的是，远离血红素铁反应中心的极性氨基酸突变也显著改变了IkaD对非天然底物催化反应的区域选择性。 

　　图2. P450酶与不同骨架的PoTeMs底物在IkaD和CftA晶体结构中的结合模式 

　　虽然参与组成P450酶催化口袋的BC和FG区域存在构象变化的现象已经广为人知，本研究首次发现了FG区域的构象差异导致同一底物1在IkaD和CftA催化口袋中以不同的姿势朝向酶反应中心，造成了二者催化反应的区域选择性和化学选择性不同。这些发现为多功能P450酶如何控制位点选择性、反应顺序和反应类型提供了蛋白三维晶体结构方面的解答，并为P450酶理性改造提供了参考，对于认知海洋天然产物生物合成途径和丰富海洋微生物酶元件库具有重要的科学意义。 

　　博士研究生蒋鹏和博士后金红波为论文的第一作者，研究员张长生和副研究员张丽萍为共同通讯作者。以上研究工作得到了国家自然科学基金项目、广东省自然科学基金、广州市科技计划项目和海南省重大科技计划项目等的资助。 

　　相关论文信息：Peng Jiang#, Hongbo Jin#, Guangtao Zhang, Wenjun Zhang, Wei Liu, Yiguang Zhu, Changsheng Zhang*, Liping Zhang*, A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates, Angewandte Chemie, doi.org/10.1002/anie.202310728 

　　文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202310728